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HRP底物分类及其操作步骤
点击次数:1010 发布日期:2018-7-13  来源:www.elabscience.cn

江苏快三开奖结果今天 www.32lyk.cn 底物范围较广,包括二氨基联苯胺(DAB)、氯萘酚和氨乙基咔唑等。

二氨基联苯胺/金属盐

        DAB是辣根过氧化物酶最敏感、常用的底物。它产生强烈的棕色产物,在水和醇中不溶解。多数情况下,推荐在DAB中加入不同的金属离子。当加入金属盐如钴、镍至底物液中,辣根过氧化物酶可以更加敏感。此类反应产物呈暗蓝灰色至黑色,且在水及醇中稳定。DAB/金属盐染色应用的组织染色范围较广。

1.     需要的溶液和特殊设备

        DAB,0.05 mol/LTris缓冲液(pH7.6), 0.3% (W/V) 氯化镍/水贮存液,  30%过氧化氢, DPX, 光学显微镜(通常带有照相机以便于记录结果).  

2.     操作步骤

        (1) 用 9 mL 0.05 mol/L Tris缓冲液(pH7.6)溶解6 mg DAB;

        (2) 加 l mL 0.3%(W/V)氯化镍/水贮存液(也可以用等量的氯化钴替代);

        (3) 加0.1 mL 3%过氧化氢。过氧化氢一般以30%的溶液提供,贮存在4 ℃,此条件可以持续1个月;

        (4) 如果出现沉淀,用滤纸过滤;

        (5) 加此溶液至标本,并孵育1~20 min水洗终止反应;

        (6) 优化:如果需要可复染;

        (7) 用DPX封片。

 

氯萘酚

        氯萘酚可以形成一种蓝黑色产物。敏感性低于DAB,且产物可溶于醇中。它适用于当DAB反应形成较高背景或要求改变产物的颜色。

1.     需要的溶液和特殊设备

        0.03%氯萘酚,用无水乙醇溶解(贮存在-20℃),0.05 mol/LTris(pH7.6),过氧化氢,Gelvatol或者Mowiol,光学显微镜(通常带有照相机以便于记录结果)。

2.     操作步骤

        (1) 氯萘酚贮存液的准备:用10 mL无水乙醇溶解0.3 g氯萘酚,贮存于-20℃;

        (2) 加100 μL 氯萘酚贮存液至10 mL 0.05 mol/LTris(pH7.6);

        (3) 加0.1 mL 3%过氧化氢于水中。过氧化氢一般是以30%的溶液提供,4℃可存放1个月;

        (4) 白色沉淀可用滤纸过滤去除;

        (5) 加此溶液到标本中,并在室温孵育10~40 min,水洗终止反应;

        (6) 优化:如果需要,进行复染,但只可使用水溶性染料;

        (7) 用Gelvatol或者Mowiol封片。

 

氨乙基咔唑

        氨乙基咔唑(AEC)产生红色产物,其敏感性低于DAB,但可用于DAB反应产生较高背景或要求改变产物颜色的实验。此产物可溶于醇,但不溶于水。

1.     需要的溶液和特殊设备

        0.4% AEC用 N,N—二甲基甲酰胺(DMF)溶解, 0.1 mol/L乙酸钠缓冲液(pH5.2),过氧化氢, Gelvatol或Mowiol,光学显微镜(通常带有照相机以便于记录结果)。

2.     操作步骤

        (1) 用 l mL DMF溶解 4 mg AEC。AEC在DMF中稳定,因此,可以用100 mL DMF溶解0.4 g AEC作为贮存液备用;

        (2) 加 l mL AEC溶液至15 mL 0.1 mol/L的乙酸钠缓冲液(pH5.2)中,并搅拌;

        (3) 加0.15 mL 3%过氧化氢于水中。过氧化氢一般是30%的溶液提供,在4℃可存放1个月;

        (4) 用滤纸过滤;

        (5) 加此溶液到标本中,并于室温孵育10~40 min,水洗终止反应;

        (6) 优化:如果需要复染,只可用水溶性染料;

        (7) 用Gelvatol或Mowiol封片。

来源:武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司
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