English | 江苏快三开奖结果今天 | 手机版 企业登录 | 个人登录 | 邮件订阅
厂商 仪器 试剂 服务 新闻 文章 视频 高级搜索 发布求购
当前位置 > 首页 > 技术文章 > 蛋白质样品中蛋白类杂质的检测方法
蛋白质样品中蛋白类杂质的检测方法
点击次数:1144 发布日期:2019-3-12  来源:本站 仅供参考,谢绝转载,否则责任自负
摘要:
本文围绕蛋白质纯度的重要性,阐述了蛋白类杂质的检测方法,包括电泳法,色谱法,沉降速率测定法,质谱法,光散射法。任何方法都不能直接定量蛋白质样品的纯度。无论最终目的是为了解释分析数据、验证过程质量,还是为了确保生物制剂产品的安全性,样品纯度的测定都是至关重要的环节。

   随着蛋白类生物制品的发展,蛋白质纯度已经成为药品管理的重大问题。在生物制品的质量指导原则中指出:除了评价原料药和药物产品的纯度,可能由预期产品和多种产品相关物质组成之外,还应评价可能出现的杂质成份。这些杂质可能是在生产过程中产生的或者是与产品相关,它们的结构可能是已知的、定性的,亦或是未知的。
    在评价样品纯度之前,首先要鉴定待测杂质的类型,如核酸、碳水化合物、脂质、无关蛋白质、同工酶类、失活蛋白质,进而确定在待测溶液中,能够区分假定杂质和目标蛋白质的理化性质(化学分析或物理特征)。纯化过程中可能已将某一杂质的浓度降低到检测限以下,但色谱峰中还有残留。毫无疑问,表观纯度取决于所选择的测定方法及其灵敏度。大多数的分离方法都能有效的去除非蛋白类杂质,下面简单介绍蛋白质样品中蛋白类杂质的检测方法。
1、电泳法
电泳法最简单、成本最低,并且在确定样品中蛋白质组分数目方面灵敏度最高,因此最为常见。通常被用于蛋白质纯度鉴定的第一步筛选,甚至应用于初期高异质性的样品鉴定。如果预期杂质与目标蛋白的分子量有差距,SDS凝胶电泳可以分辨出杂质。对于分子量相近但氨基酸组成不同的分子,SDS凝胶电泳一般分不开,但在非变性凝胶电泳中可以根据其不同的电泳迁移率进行鉴定。
然而,在采用该方法时也需要注意一些潜在的问题。对于变性凝胶,可能出现假阴性和假阳性现象。如果发生杂质共迁移或杂质无法进入凝胶的情况,会出现假阴性。因此应该将整块胶,包括浓缩胶和分离胶都染色,并且需要检验蛋白质燃料是否合适。而假阳性的产生,可能是由于在样品制备时发生共价修饰,或者胶不均一或氧化剂残留。同时在非变性凝胶中也会出现类似问题。如果杂质的静电荷为零或者与目标蛋白相反,杂质将不会出现在胶上,可以通过加宽非变性凝胶电泳的PH范围来解决。
2、色谱法
2.1 凝胶过滤色谱法
    凝胶过滤色谱法是检测与目的蛋白分子量大小不同杂质的最简单方法之一。此方法无破坏性并且非??焖?。因为此方法为样品区分法,样品通过凝胶柱时会被稀释,因此检测的样品需要有一定的起始浓度。而具体的检测量则取决于检测杂质时的灵敏度。
    凝胶过滤色谱法检测分子大小的灵敏度低于电泳法,实验需要的材料量大于电泳法。由于凝胶过滤色谱通常在天然状态下进行,结果可以反映样品的异质性。但如果蛋白质以稳定的寡聚物形式存在(如脂肪酸酶),在凝胶过滤色谱时将表现出异质性。同时,快速、可逆自联作用的蛋白质也会表现出异常浓度的洗脱谱。在出现这样情况的时候,可以从不对称或加宽峰中选取不同部分来重复凝胶过滤色谱。
2.2 反相高效液相色谱法
    反相高效液相色谱法(reversed phase HPLC),是利用如改性硅介质等非极性基质作为固定相,通过流动相中的有机溶剂减少了蛋白质与固定相的亲和力,进行极性递减的梯度洗脱,从而将蛋白洗脱下来。
由于该方法简单并且迅速,同时有现成的仪器设备,能够灵活应用于多种不同特性的蛋白质分离,因此此方法已普遍用于蛋白质样品的纯度测定。如果有需要,还可以通过改变流动相使样品在不同梯度及条件下分离,来确定主要目标物的纯度。
3、沉降速率测定法
沉降速度法,能够简单并且快速非破坏性的来测定蛋白质的纯度,同时对分子质量和分子大小的比值非常灵敏。该方法的优点在于,测定范围非常的广;但局限在于,对相对分子质量相差小的样品做测定时,灵敏度低于电泳技术。
4、质谱法
质谱法可以直接测定一个样品中共价质量的分布,此方法能够方便简便、灵敏的测定杂质。质谱法不仅可以检测杂质的存在,还可以描述杂质的质量特征,因此质谱法常被用于鉴定杂质的来源。通过串联质谱法(MS/MS),可以鉴定共价改性修饰特征和位点。由于杂质可能与主要目标物有相似的质荷比,将质谱法与其他方法(如凝胶分离色谱)联用,可以增加样品纯度测定的准确性,达到最佳的效果。
5、光散射法
目前一些仪器能够通过静态或动态光散射来测定单个样品,或者监测高效液相色谱和场级分离过程。通过对分子大小和表观分子质量的连续测定,增强鉴定洗脱蛋白质的能力,以区分待分析物、待分析物的多聚体或杂质。光散射法非常简单且无破坏性,同时能够提供洗脱时间函数的分子质量图。如果紫外检测峰不对称,通过多角度光散射(multiple angle light scattering,MALS)分析,有可能表现峰的主要部分表观分子量为mol/L,而边缘为2mol/L,说明可能存在二聚体。但出现倍数分子质量不一定能证明一定存在自身结合,还需要采用不同的方法验证此结果。
任何方法都不能直接定量蛋白质样品的纯度。通常情况下,蛋白质纯度测定涉及评价待定杂质的含量或仅仅验证蛋白质样品中是否存在杂质。无论最终目的是为了解释分析数据、验证过程质量,还是为了确保生物制剂产品的安全性,样品纯度的测定都是至关重要的环节。
来源:中科森辉微球技术(苏州)有限公司
联系电话:13693382320
E-mail:[email protected]

网友评论 已有[0]人评论
用户名: 密码: 匿名 快速注册 忘记密码
评论只代表网友观点,不代表本站观点。 请输入验证码: 8795
Copyright(C) 1998-2019 生物器材网 电话:021-64166852;13621656896 E-mail:[email protected]
  • 中国空间站国际合作:国之大者当如是 2019-05-22
  • 超出你想象  大胡子“绣郎”斩获刺绣界“奥斯卡”  2019-05-22
  • 重阳节“陪伴,是最长情的告白” 2019-05-21
  • 压倒性态势是如何形成的——党的十八大以来反腐倡廉工作综述 2019-05-21
  • 楼市下半年或持续降温 房地产长效机制加速推进 2019-05-20
  • 中国创新成果加速惠及世界 2019-05-20
  • 用餐遇收取包厢费、开瓶费、餐具消毒费等请举报 2019-05-18
  • 中国应该适当学一点米弟策略,不能够老是被动应付。 2019-05-18
  • 80亩山林被“剃光头” 森林公安半年未结案 2019-05-16
  • 回复@大雨582:没兴趣跟你扯了,智商达不到,再怎么说你也明白不了。 2019-05-16
  • Kalender von Xi bei den Zwei Tagungen 2019-05-07
  • 美对华发起第七次双反调查 专家:或另有深意 2019-05-01
  • 第二次贸易战争中国占主动 2019-05-01
  • 李克强出席澜湄合作第二次领导人会议并访问柬埔寨 2019-04-24
  • 黄志丽:做新时代的智慧型法官 2019-04-20
  • 619| 418| 371| 63| 801| 878| 264| 130| 238| 312|